观赏凤梨是一种具有易栽培、花型奇特、观赏期长、耐荫性强等特点的观赏植物，现作为装饰植物目前已被广泛种植，成为盆花产业中最主要的一大类。丽穗凤梨(Vriesea)系凤梨科(Bromeliaceae)铁兰亚科(Tillandsioideae)，是观赏凤梨的一个重要类群，具有很高的观赏价值和经济开发前景。然而，目前国内丽穗凤梨产业发展存在两个方面的问题，一是品种主要依赖进口，国内育种研究滞后；二是观赏凤梨育种周期较长，从种子播种到成花需要4~5年时间，而采用分子标记在苗期进行早期选择鉴定，可大大缩短育种进程，节约不必要的开支。

ISSR (inter-simple sequence repeat, ISSR)分子标记是一种基于PCR的简单重复序列分子标记技术(Zietkiewicz et al., 1994)，目前已成功用于百合(吴学尉等, 2009)、牡丹(索志立等, 2005)、茶树(侯渝嘉等, 2006)等植物杂交后代的鉴定。葛亚英等(2011)优化和确立了丽穗凤梨ISSR-PCR技术体系，并成功运用此分子标记对丽穗凤梨41个品种进行了遗传多样性分析和指纹图谱构建(葛亚英等, 2012)。

本研究拟采用ISSR分子标记对本中心近年创制的13个丽穗凤梨优异杂种及其5个杂交亲本进行鉴定分析，探索杂交后代与亲本间的遗传差异及其遗传关系，旨在为丽穗凤梨种质资源的早期鉴定、性状改良等研究提供科学依据。

1结果与分析
1.1丽穗凤梨杂交后代ISSR鉴定分析
通过9条引物对13个杂交后代与5个亲本进行ISSR扩增，条带统计结果表明(表1)，‘Margot’בChariotte’的杂交组合中共检测到105个位点，其中子代与父、母本共有位点58个，子代与母本共有位点13个，子代与父本共有位点14个；‘Chariotte’בCondor’的杂交组合中共检测到96个位点，子代与父、母本共有位点53个，子代与母本共表2有位点21个，子代与父本共有位点6个；‘Chariotte’בPoelmanii’的杂交组合中共检测到106个位点，子代与父、母本共有位点57个，子代与母本共有位点14个，与父本共有位点12个；‘Poelmanii’בCondor’的杂交组合中共检测到104个位点，子代与父、母本共有位点50个，子代与母本共有位点13个，与父本共有位点8个；‘White Line’בPoelmanii’的杂交组合中共检测到89个位点，子代与父、母本共有位点53个，子代与母本共有位点9个，与父本共有位点12个。
 

表1 丽穗凤梨杂交后代的ISSR鉴定 Table 1 Identification of offspring of Vriesea hybrids by ISSR

 

表2 丽穗凤梨5个亲本与13个杂交后代遗传分析的ISSR引物及其扩增结果 Table 2 ISSR primers used in analysis of genetic diversity of 5 parents of Vriesea cultivars and their offspring and their amplification results

从上述结果发现，子代与父、母亲本的共有带占多数，子代与父本也出现共有条带，而在杂交过程中控制非常严格，说明这些杂交后代是它们的亲本杂交所产生的真杂种；13个杂交后代出现的多数多态性条带分别来自父本或母本，不同子代很可能遗传双亲各自不同的优异性状，同时个别子代出现了双亲条带的缺失或出现了双亲均无的条带，说明在杂交过程中，由于基因重组产生了新的变异。

1.2丽穗凤梨杂交后代遗传多样性分析
9条ISSR引物在13个杂交后代与5个亲本共扩增出112个位点，其中多态性位点88个，多态性比例为78.57% (表2)。利用 POPGEN1.31软件计算各位点的有效等位基因数目(Ne)，Nei's基因多样性指数(He)以及Shannon信息指数(I)等遗传参数，结果18份材料平均观察等位基因数、平均有效等位基因数、平均Nei's基因多样性指数和平均Shannon信息指数分别为1.785 7、1.496 4、0.288 1和0.428 1。就单个位点而言，其遗传多样性程度差别较大，有效等位基因数、Nei's基因多样性指数和Shannon信息指数的变异范围分别为1.057 9~1.994 2、0.054 8~0.498 5和 0.128 3~0.691 7，表明本研究亲本及杂交后代存在丰富的遗传多样性。
 
根据ISSR扩增结果，对13个杂交后代与5个亲本进行UPGMA聚类分析(图1)，在相似系数0.68处把18份材料分为3组，其中P5独立成为一组，说明它与其亲本及同一杂交组合的后代分离较大。
 

图1 丽穗凤梨13个杂交后代与5个亲本的UPGMA聚类图 Figure 1 The UPGMA phylogenetic tree of thirteen offspring of Vriesea hybrids and their parents

基于ISSR标记的Dice相似系数，对13个丽穗凤梨杂交后代与5个亲本的二维主坐标分析，结果表明(图2)，第1、2主坐标(PC1, PC2)可以解释33.28%的总变异。杂交后代与亲本间距离多数较远，并且同一杂交组合的不同杂种单株间差异也较大，说明杂交可以明显拓宽丽穗凤梨的遗传基础，丰富遗传多样性。
 

图2 13个丽穗凤梨杂交后代与5个亲本基于ISSR标记的Dice相似系数的二维主坐标分析 Figure 2 Two-dimensional plot of principal coordinates analysis for thirteen offspring of Vriesea hybrids and their parents, derived from ISSR-based Dice similarity matrix

2讨论
由于丽穗凤梨育种周期比较长，所以在进行杂交后代筛选时，判断其是否为真正杂种的早期鉴定是非常重要的。早期了解杂交后代是否是真杂种，再预测其遗传性状是偏向于母本多一些还是偏向于父本多一些，从而判定是否要继续培育种苗，从而加速选育效率，降低育种成本(吴学尉等, 2009)。杂种鉴定方法有形态学鉴定、细胞学鉴定、分子鉴定、基因组原位杂交技术和同工酶鉴定等(孙春青等, 2010)，其中基于DNA多态性的分子标记鉴定具有信息量丰富，不受任何环境因素影响等优点(Agarwal et al., 2008)，并已广泛地应用到植物杂种真实性的鉴定中。Zhang等(2012)利用AFLP标记和系谱数据分析光萼荷属植物及其杂种的遗传关系；Divakaran等(2006)利用RAPD和AFLP标记分析了香草种间杂交和杂种与自交种的分子特性；Bianco等(2011)采用ISSR分子标记和形态学对朝鲜蓟F1代杂种进行了鉴定。本研究利用ISSR分子标记对丽穗凤梨杂种和亲本进行鉴定，分析条带多、清晰，多态性丰富，从而为丽穗凤梨杂交鉴定提供了一种有效的分子鉴定方法。

本研究中多数引物扩增出的条带中，后代出现的多态性条带或来源于母本，或来源于父本。但部分引物的扩增条带中，出现了与理论不相符的两种现象，一是杂交后代出现了条带的缺失，即在父、母本中出现的条带在后代中没有出现。上述现象也存在于其它作物，陈琼等(2007)认为其主要原因是配子形成过程中染色体发生交换及 DNA突变所造成的位点丢失，而唐建民等(2006)在对小金海棠进行RAPD和SSR鉴定中则认为缺失带型是不可靠杂种带型；二是杂交后代出现了增加条带，即父、母本中没有出现的条带在杂交后代中出现。吴学尉等(2009)推测这些新条带可能是由于配子形成过程中染色体的不等价交换产生的新片段。因此，杂交后代中条带的缺失或新条带的增加，能否作为判断杂种的依据，还需要了解出现条带缺失的真正原因或新条带的确切来源。

3材料与方法 
3.1实验材料
以丽穗凤梨优异品种‘Chariotte’、‘Margot’、‘Condor’、‘Poelmanii’和‘White Line’为亲本材料，2008年5月份在浙江省农科院花卉研究开发中心设计5对杂交组合，分别为‘Margot’בChariotte’、‘Chariotte’× ‘Condor’、 ‘Chariotte’בPoelmanii’、‘Po- elmanii’בCondor’、‘White Line’בPoelmanii’。亲本为4年生开花植株，母本于散粉前1 d去雄，后用单封口塑料管套住，次日收集父本花粉进行杂交，杂交后仍用塑料管套住，并记录。成熟种子采收处理后直接播种育苗，2011年初进行催花处理，观察比较后筛选出13个表现优异的杂种单株(表3)。
 

表3 丽穗凤梨5个亲本和13个优异杂交后代的名称 Table 3 Name of 5 Vriesea cultivars and 13 Selected offspring of hybrids

3.2 DNA提取
取13个优异杂种单株和5个亲本材料的嫩叶，采用改良的CTAB法提取DNA。

3.3 ISSR分析
ISSR-PCR扩增反应在2720型PCR扩增仪(美国Applied Biosystems公司生产)上进行。20 μL PCR反应体系中含30 ng模板DNA，10×PCR Buffer 2.0 μL，25 mmol/L Mg²⁺ 1.2 μL，10 mmol/L dNTPs 0.4 μL，10 μmol/L引物3.0 μL和5 U/μL Taq DNA聚合酶0.25 μL。

根据葛亚英等(2012)筛选得到的ISSR引物序列中，选取其中9条用做本实验PCR扩增引物。100 bp DNA marker、10×Buffer、MgCl₂、dNTPs以及Taq DNA聚合酶购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司杭州分公司，引物由上海生工有限公司合成。

ISSR-PCR扩增程序同葛亚英等(2012)：94℃，4 min；(94℃, 30s; 48℃~56℃, 45 s; 72℃，1 min)×40；72℃，6 min。PCR扩增产物在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染显色。

3.4数据处理
对扩增产物的电泳凝胶进行分析，凝胶上某个相同迁移率位置上无扩增带的记为“0”，出现扩增带的记为“1”，模糊不清的条带剔除。利用POPGEN v1.31软件(Yeh et al., 1999, http://www.ualberta.ca/~fyeh/popgene.pdf)对群体遗传参数(多态位点百分率, 观察等位基因数, 有效等位基因数, Nei's遗传多样性指数和Shannon信息多样性指数等)进行计算。采用NTSYSpc V2.0软件(Rohlf, 2000, http://www.exetersoftware.com/downloads/ntsysguide.pdf)构建亲本与杂交后代Dice相似系数的二维主坐标图，分析杂交后代与亲本的遗传关系。

作者贡献 
葛亚英、张飞是本研究的实验设计和实验研究的执行人；葛亚英完成数据分析，论文初稿的写作；张飞完成论文修改，王炜勇、沈晓岚、田丹青和俞信英参与实验，试验结果分析；郁永明是项目的构思者，指导实验设计；全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢 
本研究由浙江省重大科技专项(2009C12095)、杭州市种子种苗项目(20101532H06)和浙江省农科院创新能力提升项目共同资助。

参考文献
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